IDENTIFIKASI VIRUS TUMBUHAN Identifikasi virus sebagai penyebab penyakit merupakan faktor kunci yang menentukan keberhasilan pengendalian dilapangan. Identifikasi berdasarkan gejala kasat mata sering tidak cukup untuk menentukan virus penyebeb penyakit. Gejala dapat disebabkan oleh infeksi campuran dari beberapa virus, atau virus yang berbeda dapat menimbulkan gejala yang sama. Pada awal perkembangan diagnosis penyakit virus, gejala penyakit memegang peranan penting untuk menentukan apaka suatu satu gejala disebabkan oleh satu jenis virus atau lebih. Pengamatan gejala yang di ikuti oleh pengamatan mikroskop elektron dilakukan untuk mengetahui bentuk virion yang menginfeksi tanaman. Saat ini, deteksi dan identifikasi virus dapat dilakukan menggunakan teknik biologi molekul yang didasarkan atas runutan nukleotida genom virus yang khas. A.Tujuan identifikasi virus 1.Menderminasi dan mengidentifikasi virus di suatu tempat guna mengantisipasi bahwa : a.Pada satu jenis tumbuhan ditemukan virus yang berlainan jenis atau grup b.Musim tanam berpengaruh pada keberadaan jenis atau strain virus tertentu di daerah berbeda. 2.Mendeterminasi : a.Isolat virus baru yang dan belum pernah ditemukan sebelunya. b.Varian atau strain dan membedakannya dari suatu virus yang sudah diketahui. c.Keidentikan suatu isolat dengan virus yang sudah diketahuiterdapat disuatu daerah atau tumbuhan tertentu, hasil pengujian ini berguna untuk menempatkannya dalam taksa dan klasifikasi virus. 3.Mengidentifikasi fungsi genomdan sekuensi nukleotida asam nukleat atau asam amino dalam protein,serta fungsi protein virus dalam inang. 4.Mengetahui sifat-sifat virus dan stabilitasnya selama eksperimen berlangsung, hasilnya digunakan intuk determinasi virus. B.Identifikasi virus berdasarkan sifat hayati dan bentuk virion sifat virus yang menjadi dasar identifikasi virus adalah gejala penyakit, kisaran tanaman inang, dan kekhasan vektor. Selain itu mikroskop elektron juga dapat digunakan untuk mengetahui genus dan famili virus berdasrkan bentuk dan ukuran virion. Beberapa hal yang perlu diketahui agar identifikasi virus dapat dengan mudah diketahui,adalah sebagai berikut : 1.setiap virus mempunyai kisaran inang yang berbeda,sahingga hubungan khas antara virus dan tanaman inang dapat dijadikan sebagai salah satu cara identifikasi virus. 2.Babarapa virus mugkin dapat menginfeksi satu jenis tanaman inang,tetapi salah satu virus menginfeksi sacara sistemik dan yang lainya hanya menginfeksi sacera lokal. 3.Setipa virus mempunyai vektor yang berbeda, sehingga bebab ini dapat dijadikan sebagai salah satu cara untuk mengetahui virus tersebut. Identifikasi berdasarkan sifat virus : 1.Identifikasi berdasarkan gejala dan kiasaran tanaman inang. Gejala penyakit virus dilapangan merupakan data pertama yang diperlukan untuk identifikasi virus. Demikian juga dilaboratorim, gajala penyakit yang ditimbulkan pada suatu seri tanaman indikator merupakan informasi yang diperlukan untuk identifikasi virus tumbuhan.gejala penyakit merupakan aspek yang sangat penting untuk menentukan tindakan untuk pengendalian penyakit terutama untuk para petani dan petugas pertanian. Identifikasi berdasarkan gejala penyakit sering membingungkan karena gejala penyakit yang timbul dipengaruhi oleh strain dan varietas tanaman serta faktor lingkungan yang dapat mempengaruhi ekspresi gejala infeksi virus tersebut. Gejala infeksi dan kisaran tanaman inang telah digunakan untuk identifikasi virrus tumbuhan. Sebagai contoh, untuk membedakan penyebab penyakit yang menimbulkan gejala bilur( blotch ) pada kacang tanah disebabkan oleh PStV atau PmoV dapat dilakukan dengan menginokulasikan ekstrak tanaman secara mekanik pada tanaman Chenopodium amaranticolor dan phaseolus vulgaris varietas topcrop. PStV akan menimbulkan gejala bercak lokal pada Chenopodium amaranticolor dan tidak menginfeksi phaseolus vulgaris, sebaliknya PmoV akan menimbulkan gejala bercak lokal pada phaseolus vulgaris dan tidak menginfeksi Chenopodium amaranticolor. 2.Identifikasi virus berdasarkan kekhasan vektor Virus yang menyerang tanaman dapat diidentifikasi berdasrkan hubungan khas virus dan vektornya. Sebagai contoh, virus yang secara alami menyerang kedelai terdiri dari atas soybean stunt virus (SSV ),indonesian soybean dwarf virus ( I-SDV , bean yellow mosaik virus ( BYMV ), soybean yellow mosaik virus ( SYMV ), soybean mosaik virus ( SMV ), peanut srtipe virus ( PStV ),cowpea mild mottle virus ( CPMMV) ; dan hanya CPMMV yang dapat ditularkan oleh Bemisia tabacci. Berdasarkan hubunga khas itu, apabila tanaman kedelai menunjukkan ghejala openyakit virus dari lapangan, dapat dikatakan bahwa patogennya adalah CPMMV. 3.Identifikasi dengan mikroskop elektron Mikroskop elektron yang mempunyai pembesaran > 50.000 kali, dapat digunakan untuk mengamati virion. Identifikasi menggunakan mikroskop elektron dapat dilakukan dengan mengamati bentuk dan ukuran virion. Berdasarkan bentuk dan ukuran virion tersebut dapat ditentukan jenis virus yang menyerang tanaman. C.Identifikasi berdasarkan sifat molekul virus Deteksi virus berdasarkan runutan nukleotida genom virus merupakan metoda yang khas karena runutan nukloetida genom virus berbeda untuk setipa jenis virus. Hasil pengamatan menunjukan bahwa virus yang berada pada kelompok taksonomi yang berbeda hanya menpunyai kesamaan runutan nukleotida 39%-53%. Sebaliknya, virus dalam spesies yang sama tetapi strain yang berbeda, mempunyai kesamaan 83%-99%.oleh sebab itu, penggunaan sifat sifat kekhasan runutan nukleotida virus untuk deteksi dan identifikasi virus mempunyai ketetapan yang tinggi terhadat virus sasaran. Deteksi berdasarkan kekhasan runutan nukleotida dapat dilakukan dengan teknik RT-PCR dan DNA pelacak( probe ). 1.Deteksi virus mengunakan teknik PCR PCR merupaka teknik biologi molekul yang pertama kali diperkenalkan pada tahun 1985.PCR merupakan teknik yang relatif sederhana dan merupakan teknik penggandaan ( amplifikasi ) dengan mangunakan DNA primer yang memiliki runutan nukleotida yang khasuntuk molekul asm nukleat yang akan di deteksi. Primer merupakan molekul oligonukleotida (ssDNA) yang disintesis in vitro dan runutan nukleotidanya disesuiakan dengan genom virus yang akan dideteksi. PCR hanya akan mengandakan asam nukleat sesuai asm primer. Hasil panggandaan PCR diamati menggukan elektroforesisagarose dan sinar ultraviolet. Deteksi untuk virus yang memiliki genom RNA, seperti sebagian besar virus tumbuhan, diperlukan midifikasi teknik PCR karena molekul sasaranya adalah RNA. RT-PCR merupakan modifikasi dari teknik PCR yang dapat manggandakan RNA menjadi DNA . indikasi adnya virus dengan teknik ini diamati dengan elektroforesis gel agarosa. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya penggunaan DNA yang ditargetkan dan khas terhadap virus yang ingin diketahui. Hal yang mempengaruhi keberhasilan deteksi virus dengan teknik PCR adalah pemilihan primer oligonukleutida dan optimasi prosedur PCR. Pemilihan primer oligonukleotida target harus mangacu pada runutan nureaksi kleotida virus yang telah diketahui atau sudah dipublikasikan. Untuk target diagnosis runutan nukleotida target harus berkisar antara 100-600 bp,dan mempunyai kandungan GC 50%, serta tidak terjadi struktur yang mengumpul (haipin). RT-PCR terdiri atas dua reaksi, yaitu reaksi transkripsi balik yang menggunakan genom RNA virus sebagai cetakan dan manghasilkan c DNA primer (untai tunggal) serta reaksi penggandaan (PCR). Untuk mendapatkan c DNA untai ganda, c DNA primer digunakan sebagai cetakan.RT-PCR akan mengadakan runutan nukleotidapada genom RNA virus. Primer yang digunakan harus dapat menggandakan bagian khas virus yang akan dideteksi. Sebagai contoh,Akin (2000), menyerang kacang tanah, dengan metoda RT-PCR pasangan primer PST1 dan PST2, yang akan mengaplikasikan 234 bp yang merupakan c DNA dari sebagian 3’UTR dan gen CP ; sedangkan pasangan PST1 dan PST4 menghasilkan c DNA1,2 Kb. 2.Deteksi virus tumbuhan dengan pelacak DNA Pelacak DNA adalah sepotong oligonukleotida yang mempunyai runutan basa yang komlemen dengan runutan nukleotida virus yang kan di deteksi. Untai tunggal pelacak DNA itu akan berpasangan dengan asam nukleat virus yang basanya komplemen dengan pelacak. Perpasangan dua untai DAN membentuk untai ganda dsDNA terjadi secara antiparalel dan masing-masing untai di ikat oleh ikatan hidrogen pada basa purin dan pirimidin (G=C dan A=T) untai DNA yang terpisah cendrung berpasangan lagi sesuai untai pasangannya. Sifat kekhasan berpasangan itu di manfaatkan untuk membuat potongan pelacak untuk deteksi khas virus.